(Аутор: Nicole Jawerth, извор: Билтен МААЕ, јун 2020. године)
Како се вирус корона који изазива COVID-19 инфекцију шири на глобалном нивоу, МААЕ, у сарадњи са Организацијом за храну и пољопривреду при УН (енг. FAO), обезбеђује подршку и експертизу да помогне земљама да користе real time реверзну транскрипцију ланчане реакције полимеризације (енг. real time RT–PCR), као један од најбржих и најпрецизнијих лабараторисјких метода за откривање, праћење и пручавање COVID-19 вируса.
Логично, поставља се питање шта је то real time RT–PCR? Како функциониш, како се разликује у односу на PCR и какве то везе има са нуклеарном технологијом?
Шта је real time RT–PCR?
Real time RT–PCR је метод заснован на нуклеарној технологији за откривање присуства специфичног генетичког материјала у било ком патогену, укључујући и вирусе. За откривање циљаног генетичког материјала овом методом првобитно су се корстили радиоактивни изотопи као маркери, да би се каснијим унапређењима они заменили специјалним маркерима и то најчешће флуоросцентним бојама. Ова техника омогућава научницима да скоро истог тренутка виде резултате док се сам процес још увек одвија, за разлику од конвенционалне RT–PCR којом се резулати добијају тек на крају самог процеса.
Real time RT–PCR је једна од највише коришћених метода за откривање вируса COVID-19. Иако велики број земаља већ примењује ову технику за откривање и дијагностику других болести као што су Ебола или Зика вирус, некима је ипак потребна подршка у његовом прилагођавању за вирус COVID-19, као и повећавању националних капацитета за тестирање.
Шта је вирус? Шта је генетски материјал?
Вирус је микроскопско паковање генетског материјала унутар молекуларног омотача. Овај генетски материјал може да буде или дезоксирибонуклеаинска кислеина (ДНК) или рибонуклеинска киселина (РНК).
ДНК је дволанчани молекул присутан у свим организмима као што су животиње, биљке и вируси који садржи генетски код или план настанка и развоја свих ових организама.
РНК је у принципу молекул састављен из једног ланца који копира, транскрибује и преноси генетски код до протеина како би се они синтетисали и спроводили све функције неопходне за живот и развој организма. Посебне варијације РНК су задужене за копирање, транскрибовање и преношење.
Неки вируси попут SARS-CoV-2 коронавируса који изазива COVID-19 садрже само РНК, што значи да се умножавају и опстају инфилтрирањем у здраве ћелије. Након што се нађе у ћелији, вирус користи сопствени генектски код – што је РНК у случају COVID-19 вируса – како би контролисали и „репрограмисали“ ћелије и тако их претварали у својеврсне фабрике вируса.
Како би се вируси попут COVID-19 рано детектовали у телу коришћењем real time RT–PCR метода, научници прво морају да конвертују РНК у ДНК. Овај процес се назива „реверзна транскрипција“, а спроводи се јер једино ДНК може да се копира – или амплификује – што је кључни део у детектовању вируса помоћу real time RT–PCR метода.
Научници умножавају одређени део транскрибованог вирусног ДНК стотинама хиљада пута. Амплификација или умножавање тако омогућава научницима да, уместо уочавања минијатурне количине вируса у милионима ланаца генетских информација, користе довољно велике циљане делове вирусног ДНК да прецизно потврде присуство вируса.
Како real time RT–PCR функционише код COVID-19 вируса?
Из делова тела у којима се COVID-19 вирус обично депонује, као што су нос или грло, се узима узорак који се потом третира са неколико хемијских раствора чиме се уклањају протеини или масти и оставља само РНК у узорку. Тако добијена РНК је мешавина генетског материјала појединца и РНК вируса, ако је присутан.
Помоћу посебног ензима РНК се реверзно транскрибује у ДНК, а онда се додају кратки фрагменти ДНК који су комплементарни са одређеним деловима транскрибованог вирусног. Ако је вирус присутан у узорку, ови фрагменти се везују за циљане делове вирусног ДНК. Неки од додатих генетских фрагмената се користе за изградњу ланаца ДНК у процесу умножавања, а други за изградњу ДНК и додавање маркера ланцима, који се потом користе за детектовање вируса.
Ова мешавина се потом поставља у RT–PCR машину која се циклично креће кроз температуре које загревају и хладе мешавину и тако доводе до специфичне хемијске реакције којом се стварају нове идентичне копије циљаних делова вирусног ДНК. Овај циклус се потом понавља, а сваким циклусом се претходни број дуплира. Стандардни real time RT–PCR обично пролази кроз 35 циклуса, што значи, да на крају процеса, добијамо 35 милијарди копија делова вирусног ДНК из сваког ланца вируса присутног у узорку.
Како настају нове копије делова вирусног ДНК, маркери се додају на ланце ДНК и испуштају флуоросцентну боју чију количину одређује компјутер машине и приказује је у реалном времену на екрану. Након сваког циклуса компјутер бележи количину флуоросцента у узорку. Када се пређе одређена количина флуоросцента, то је сигурна потврда присуства вируса. Научници бележе и број циклуса који је потребан за постизање ове границе, али и процену озбиљности инфекције. Другим речима, што је мање циклуса, то је вирусна инфекција озбиљнија.
Зашто користити real time RT–PCR?
Real time RT–PCR техника је веома осетљива, прецизна и обезбеђује поуздану дијагнозу за нешто мање од 3 сата, иако је лабараторијама потребно у просеку од шест до осам сати. У поређењу са другим методима изоловања вируса, real time RT–PCR је значајно бржи и има мању могућност контаминације или грешке јер се целокупан процес може спроводити унутар затворене цеви. И даље је ово најпрецизнији метод који нам је доступан за детектовање вируса COVID-19.
Real time RT–PCR се, међутим, не може користити за детектовање прошлих инфекција, што је значајно за разумевање развоја и ширења вируса који су у телу присутни само одређено време. Стога су потребни други методи како би се откриле, пратиле или проучавале претходне инфекције, поготово оне које су настале и шириле се без испољавања неких посебних симптома.
Шта је PCR и како се он разликује од real time RT–PCR?
RT–PCR је варијација PCR или ланчане реакције полимеризације. Ове две технике користе исти поступак, с тим што RT–PCR укључује и реверзну транскрипцију РНК у ДНК како би се омогућило умножавање. То значи да се PCR користи за патогене као што су вируси или бактерије који већ садрже ДНК за умножавање. Обе технике је могуће спроводити у „реалном времену“ што значи да су резултати доступни и видљиви скоро истог тренутка, док су они код конвенционалних метода видљиви тек на крају реакције.
PCR тест је један од најчешће коришћених дијагностичких тестова за откривање патогена, укључујући и вирусе који узрокују Еболу, афричку свињску кугу, слинавку и шап. Пошто вирус COVID-19 садржи само РНК, за његово детектовање се користи real time или конвенционални RT–PCR.
Више од 20 година, МААЕ, у сарадњи са Организацијом за храну и пољопривреду при УН, обучава и опрема стручњаке из свих делова света да користе real time RT–PCR метод, нарочито преко своје VETLAB мреже лабараторија за дијагностику у ветерини. У последње време се ова техника користи и за дијагностификовање других болести као што су Ебола, Зика вирус, блискоисточни акутни респираторни синдром MERS као и тешки акутни респираторни синдром SARS, али нека друга озбиљна обољења животиња. Користи се и за детектовање неких озбиљнијих зоонотских обољења, односно обољења животиња која могу да се пренесу и на људе.